生物制药下游工艺中的除病毒过滤 ：关键因素和当前限制

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2025-10-20             环球过滤分离技术网                guolvfenlitech6

除病毒是生物制药生产过程中的一个关键环节，可确保生物制药的安全。除病毒过滤广泛应用于生物制药下游工艺，通过基于尺寸排阻机制将小病毒（例如，大小为 18-26 nm的细小病毒）与生物制药（例如，大小约为 12 nm的单克隆抗体）分离，有效去除病毒（即病毒去除达4-log10 以上，产品回收率高）。本文回顾了过滤器形态、进料溶液成分和高通量除病毒过滤性能等关键因素，主要关注病毒去除效率的对数降低值。还讨论了液流中断和蛋白质污染问题。

简介

必须确保生物制药生产过程中的病毒安全，因为用于生产生物制药的细胞培养物容易受到病毒污染。下游工艺过程除病毒能力至关重要。目前的除病毒指南建议使用至少两种正交方法来清除病毒：采用低pH处理（和/或添加溶剂和洗涤剂）的化学灭活方法和除病毒过滤方法。已知或未知病毒至少减少 4-log10。在各种除病毒方法中，除病毒过滤工艺是一种强大的、基于尺寸的病毒去除工艺，不会损害生物药。具体来说，除病毒过滤可有效去除有囊膜病毒和无囊膜病毒，而病毒灭活仅对有囊膜病毒有效。例如，除病毒研究中最坏情况的小鼠病毒通过应用单次除病毒过滤被去除了超过4-log10，实现了超过40%的总病毒去除，在下游工艺中，除病毒过滤可应用于任何阶段；然而，优选在较后的阶段（例如，在初级捕获步骤之后），以尽量减少杂质造成的工艺影响。除病毒过滤最初以切向流过滤进行，其中施加的压力方向垂直于溶液滤液，以减少蛋白质污染和浓差极化效应等副作用。为确保工艺简单和成本效益，目前的除病毒过滤工艺采用直流过滤，施加的压力的方向与滤液方向相同。为了降低直流过滤中除病毒过滤器表面蛋白质沉积和浓差极化的潜在风险，除病毒过滤器的皮层侧置于滤液附近。

除病毒过滤器可分为大型病毒截留过滤器（标称孔径约为 50 nm，用于去除逆转录病毒）和小型病毒截留过滤器（标称孔径约为 20 nm，用于去除细小病毒）。传统的除病毒过滤过程大多需要小型病毒截留过滤器，因为它们可以有效去除大病毒和小病毒。除病毒过滤器应该能够有效去除病毒，同时允许所需产品通过；这极具挑战性，主要是因为细小病毒（18-26 nm）和生物制药产品（例如~12nm的mAb）之间的尺寸相似性。此外，在除病毒过滤器用于下游工艺前，所有除病毒过滤器必须通过完整性测试，以及病毒去除、泄漏、蛋白质传输和生物安全测试。然而，即使遵循所有严格的验证程序，除病毒过滤工艺中病毒突破和产品损失（即蛋白质污染）仍有可能发生，从而导致产品安全和经济问题。

迄今为止，已经发表了多篇与除病毒以及病毒灭活/过滤工艺相关的下游工艺的综合评论论文。在最近发表的一篇综述论文中，主要关注了除病毒工艺的工艺验证以及程序的未来发展。本文将综合性介绍除病毒过滤，重点介绍影响该工艺的关键因素和目前的局限性。通过过滤器进行病毒去除的机理主要取决于孔结构的尺寸排阻，此外还有过滤材料的化学相互作用，例如静电和疏水相互作用。本文特别强调了膜孔形态、进料溶液组成和高通量条件下的载量等影响病毒去除的因素，后者以对数降低值（LRV）表示。此外，文章将讨论过程中断的影响，例如液流中断和蛋白质污染，并介绍当前应用连续工艺的局限性。

影响病毒去除效果的关键因素

通过过滤去除病毒的机制

生物制药下游工艺中除病毒过滤的示意图如下图1所示，使用过滤器去除病毒可以通过尺寸排阻机制来解释，其中病毒被捕获在过滤器的病毒截留区域，其工作原理类似于深层过滤器。过滤过程中病毒颗粒被去除，而生物制药产品则被传输，回收率很高（>95%）。与传统的超滤膜相比，为了在获得高病毒截留率的同时获得较高的产品产量，除病毒过滤器的病毒截留区域具有较窄的孔径分布（PSD）。PSD和其它膜孔特性，如孔径梯度、孔隙连通性和对称性，是除病毒过滤性能的重要贡献者。根据膜的形态，病毒截留区域可以是除病毒过滤器的顶部或底部区域。

图1. 除病毒过滤过程中病毒去除和单克隆抗体传输的示意图。

如图1所示，病毒主要根据其大小以及一些化学相互作用（即病毒与过滤器表面之间的静电和疏水相互作用）而被捕获到截留区。自然界中，病毒被认为是带电胶体，而介质完全是中性的。介质中病毒的中性可以通过双电层的形成来解释：病毒颗粒的反离子形成第一层，靠近病毒表面（主层），扩散离子形成厚的第二层（Gouy层）。一旦病毒和过滤器表面带相反电荷，它们之间就会存在静电力，引起表面相互作用，从而使病毒吸附在过滤器表面上。在之前的研究中，普遍采用 Langmuir 和 Freundlich 理论来理解病毒吸附。两种理论都假设单层吸附，但Langmuir理论假设吸附剂表面能量分布均匀。Langmuir 和 Freundlich 理论分别用方程 1 和方程 2 表示：

其中，Rateads为吸附速率，ka为速率常数，Cv为病毒浓度，Xm为吸附位点总数，Xocc为占据的吸附位点。

其中Xads是游离病毒的比例（=吸附病毒/吸附剂重量），K和n是给定吸附质的常数，C是悬浮平衡中的病毒。

介质中病毒和过滤器表面的电荷由物质的等电点 (pI) 决定。当溶液的pH值高于病毒/过滤器的pI值时，表面带负电；相反，如果溶液的pH值低于pI值，则表面带正电荷。先前的研究已经表明膜和病毒之间的表面电荷对病毒吸附的影响。例如，Wang等人揭示了吸附在土壤上的 ΦX -174 和 MS2 噬菌体等多种病毒会受到溶液 pH 值的影响，表明病毒的 pI 与其吸附有关行为表现在表面上。Dowed 等人报道说，噬菌体 MS2 和沙土在环境 pH 值下均带负电荷，由于静电排斥力，导致吸附量减少。Voorthuizen 等人报道，带中性电荷的病毒颗粒会导致病毒聚集，并且在微滤过程中表现出比带负电荷的病毒时更高的 LRV。Dika 等人研究了噬菌体的电泳迁移率以及由于静电相互作用而导致的膜粘附差异，结果表明电泳迁移率与噬菌体的 pI 值之间没有相关性。这些有争议的结果表明必须使用多种方法来测量病毒的 pI 值。然后，必须指出测量 pI 值的最佳和最准确的方法，以阐明静电相互作用对病毒的吸附。这将有助于了解病毒与膜表面之间的静电相互作用/排斥引起的病毒去除性能的变化。

疏水相互作用是病毒吸附到病毒过滤器表面的另一种机制。在除病毒过滤中，病毒的疏水部分和过滤器表面倾向于优先彼此相互作用，而不是与水相互作用，这可以增强病毒和过滤器之间的吸附，从而提高性能。关于疏水相互作用的研究主要集中在预过滤上，以去除不需要的蛋白质聚集体，而不是病毒-过滤器相互作用。然而，已知细小病毒比蛋白质更具疏水性，并且了解病毒、过滤器表面和蛋白质之间的疏水相互作用可能有助于更高的病毒去除率和更好的蛋白质传输。

商用除病毒过滤器的特性

商用过滤器的代表性材料、物理性能和病毒去除性能总结于表1中。商用除病毒过滤器由单层或多层的聚合物材料、对称或不对称的过滤器形态组成，目的是产生高去除性能。对于生物制药下游工艺中的除病毒过滤，使用直流过滤（NFF）系统确保了高产品回收率和工艺简单性，其中施加的压力方向和溶液滤过方向相同。如表1所示，Ultipor® DV50、PlanovaTM35 N和Virosolve® NFR等过滤器用于去除大型病毒，如鼠白血病病毒、猿猴病毒40和牛病毒性腹泻病毒。同样，PegasusTM SV4、Prime、Ultipor® DV20、PlanovaTM BioEX、15 N、20 N、Virosolve® NFP、PRO、Virosart® CPV 和 HF 用于去除小病毒，如猪细小病毒 (PPV)、MVM、和细小病毒 B19。如前所述，除病毒过滤最常用的是使用小型病毒截留过滤器。

表 1.商用除病毒过滤器的物理特性。

通常使用基于聚合物的除病毒过滤器，因为它们可以实现快速去除和高产品回收率，并且不会对产品产生不利影响。用于除病毒过滤的代表性聚合物是聚偏二氟乙烯（PVDF）、聚醚砜（PES）和再生纤维素（RC），它们具有低蛋白质吸附、高耐溶剂性、广泛的pH耐受性和高流速的优点。具体而言，过滤器上的低蛋白质吸附对于最大限度地减少产品损失非常重要。RC 过滤器具有最低的蛋白质吸附，而 PVDF 和 PES 过滤器具有卓越的机械强度，可在更高的施加压力下实现更高的通量。此外，一些PVDF 和 PES 过滤器进一步亲水化，以减少蛋白质吸附。例如，由铜氨再生纤维素 (CRC) 组成的 PlanovaTM N 系列过滤器的适当工作压力为 0.98 bar，最大入口压力约为 2.94 bar。相比之下，基于 PVDF 的 PlanovaTM BioEX 适合在高达 4.4 bar 的较高压力下运行。过滤材料并未被视为影响除病毒过滤过程中 LRV 变化的主要因素，因为主要的病毒去除机制由尺寸排阻模型来解释。因此，基于过滤材料的LRV的比较是有限的。Marques 等人显示了 RC 过滤器 (PlanovaTM 20 N) 在流量衰减方面优于 PVDF 和 PES（分别为Virosolve® NFP 和 Virosart® CPV）过滤器。然而，该研究是有限的，因为每个过滤器都在建议的操作条件下运行，表明不同的初始滤液通量涉及不同的流量衰减倾向。由于当前生物工艺对高度浓缩的产品液流的需求不断增加，过滤材料可能成为影响除病毒过滤性能（在产品收率和 LRV 方面）的重要因素。

商用小型病毒截留过滤器在病毒截留区域的平均孔径约为 20 nm，略小于细小病毒的平均孔径（通常为 18-26 nm）。如表 1 所列，不同的商用过滤膜形态和层数提供了适用于特定条件的特定性能特征。图 2 显示了商用除病毒过滤器（PlanovaTM 20 N、Viresolve®NFP、Viresolve® PRO 和Ultipor® DV20）的扫描电子显微镜 (SEM) 图像。SEM 图像表明商用除病毒过滤器具有独特的形态。PlanovaTM20 N 和 Viresolve® PRO 表现出相对不对称的孔隙结构，入口和出口之间具有不同的孔径和孔隙密度。相比之下，Ultipor® DV20 在整个过滤区域表现出相对对称的孔形态。Viresolve® NFP 被称为一种不对称过滤器，在微滤膜上涂有一层薄薄的病毒截留层。与 Ultipor® DV20 和 Viresolve®PRO 过滤器的荧光标记纳米颗粒截留能力相比，不同的膜形态显示出不同的病毒截留能力，如图 3 所示。对纳米颗粒混合物（20、40 和 100 nm）的同时过滤表明，使用 Ultipor® DV20 会产生由所有颗粒尺寸的混合物组成的松散层，而在滤液附近发现了 40 和 100 nm 颗粒的明显薄层，20 nm 颗粒分布广泛。随后，将讨论孔形态对病毒去除性能的影响，包括病毒截留可视化方法。

图 2.商用除病毒过滤器的扫描电子显微镜 (SEM) 图像（横截面）(a) PlanovaTM 20 N、(b) Viresolve® NFP、(c) Viresolve®PRO 和 (d) Ultipor® DV20。

图 3. (a) Ultipor® DV20 和 (b) Viresolve® PRO过滤器对荧光标记纳米颗粒的截留。

影响病毒去除效果的因素

孔隙形态

在生物制药领域，病毒过滤设备需具备比市售超滤膜更精细的孔径分布（PSD），以确保高效去除病毒。研究显示，微小的缺陷在过滤过程中可能导致病毒穿透，因此对PSD的研究至关重要。先前的研究通过多种技术手段，如葡聚糖过滤、液-液孔隙率测试（LLP）和金纳米颗粒（GNP）捕获测试，来确定市售病毒过滤设备的PSD。这些研究旨在揭示PSD对病毒捕获效率的影响，并深入理解其去除机制。

最近的研究评估了市售病毒过滤设备的孔隙结构，以探索其与病毒去除能力之间的联系。Bakhshayeshi等人利用不同分子量的葡聚糖和两种市售病毒过滤设备，分析了PSD的差异。他们的研究揭示了基于膜方向的筛分效率差异，表明两种膜的进料侧较为疏松，而滤液侧则相对致密。此外，还观察到了葡聚糖过滤方向的依赖性以及进料溶液浓度梯度的局限性。

Giglia等人采用LLP方法，研究了具有不同亲水性和孔径分布的病毒过滤设备的PSD。结果显示，Viresolve PRO®的病毒捕获区域PSD较窄，且对模式病毒的去除效率估计较高，与ΦX-174病毒的单层去除效率实验数据相吻合。

Kosiol等人通过GNP捕获测试，对商业和非商业病毒过滤设备进行了PSD的密集测量，并使用十二烷基硫酸钠（SDS）作为模式溶液，以减少GNP吸附到膜表面的影响。研究发现，第二代过滤设备的PSD较第一代更窄，平均孔径和99%截留孔径的值相近。GNP和LLP方法被用于比较商业病毒过滤设备的平均孔径，LLP方法得到的平均孔径（约20纳米）比GNP方法测量的（约15纳米）稍大，这表明需要更精确的孔径测量技术来开发下一代病毒过滤设备。

通过使用荧光标记的病毒替代物和共焦激光扫描显微镜（CLSM）观察，研究了病毒在过滤设备中的捕获机制。Bakhshayeshi等人在噬菌体PP7上标记了Alexa Fluor® 488，并比较了均质Ultipor® DV20和不对称Viresolve® PRO中的PP7捕获行为，揭示了不同的捕获位点。Ultipor® DV20的捕获位点靠近进料侧，而Viresolve® PRO的位点则靠近滤液侧。

Fallahianbijan等人开发了荧光标记纳米颗粒（FluorSpheres®），而Ayano等人则利用光学显微镜和荧光标记的病毒样颗粒（VLP）以及蛋白质，直接监测了病毒捕获和蛋白质传输的动态过程。其他用于可视化孔隙形态的方法包括透射电子显微镜（TEM）和/或扫描电子显微镜（SEM）。

Nazem-Bokaee等人使用荧光标记纳米颗粒，通过CLSM和GNP，以及SEM评估了PlanovaTM 20 N和BioEX的孔形态，结果表明两种过滤设备中的捕获行为相似，且两种可视化方法的观察结果一致。Adan-Kubo等人通过TEM分析了PlanovaTM 15 N和20 N，通过测量孔隙数量和孔径比（孔径/平均孔径）将孔隙区域区分为粗糙内层、致密中间层和粗糙外层。孔的互连性被认为是影响病毒去除性能的关键因素。

Fallahianbijan等人通过部分阻塞过滤设备的入口区域，使用GNP检查了Ultipor® DV20、Viresolve® NFP和PRO的孔隙互连性。Ultipor® DV20在阻塞区域中未显示GNP的捕获，而Viresolve® NFP和PRO在阻塞区域中观察到一些GNP，表明GNP通过互连的孔移动。Brickey等人通过聚焦离子束和SEM展示了Viresolve® PRO过滤设备的3D结构，重建的3D结构重新定义了孔隙网络，如孔隙率、PSD和孔隙互连性。过滤设备的3D结构有助于更好地理解病毒过滤设备的病毒捕获机制。

尽管在病毒过滤设备的可视化方面取得了进展，但为了全面理解病毒去除机制，仍需更精确地分析孔隙形态。

料液组成

化学因素，如溶液的pH值、电解质浓度、蛋白质种类和添加剂，对病毒清除率（LRV）有显著影响。研究已表明，不同pH和电解质浓度下，某些过滤器的LRV存在差异，强调了进料溶液化学特性在遵守现行病毒清除法规中的重要性。表2汇总了影响病毒清除性能的化学因素研究，包括过滤器类型、目标病毒、蛋白质、料液条件及其LRV结果。

Planova™系列过滤器在调整pH值、电解质浓度和蛋白质种类等进料溶液条件后进行了测试。Hongo-Hirasaki等人发现，在不同进料溶液条件下，PlanovaTM 20 N通过PPV提供稳定的LRV性能，但滤液通量受离子和蛋白质浓度影响。

表2.影响除病毒过滤的各种化学因素。

另一项研究指出，在不同电解质浓度和进料溶液条件下，含有金纳米颗粒（GNP）的1 g/L人IgG溶液的滤液通量下降行为可能显著影响病毒过滤过程。Strauss等人评估了PlanovaTM 20 N和BioEX在改变进料溶液的pH值、电解质浓度和单克隆抗体（mAb）类型后的过滤效果。研究发现，在低电解质浓度下，带相反电荷的病毒（如MVM）和模式过滤器（pH 4）表现出较高的LRV。然而，在高电解质浓度下，两种带负电荷的物质（pH 8）会产生较高的LRV。此外，研究还探讨了蛋白质类型和添加剂对病毒清除性能的影响。

Adan-kubo等人观察到基于蛋白质类型的不同病毒截留行为；人细小病毒B19在PlanovaTM 15 N过滤器中的截留随着白蛋白而向外移动，表明病毒-蛋白质相互作用改变了病毒截留行为。Bao等人使用PlanovaTM 20 N成功去除了猪圆环病毒1（PCV1），该病毒对当前的病毒灭活和去除工艺具有高度抵抗力。与其他pH条件相比，使用pH 6的0.1–0.3 M甘氨酸溶液可提高PCV1的LRV，表明补料溶液条件影响病毒清除性能。PlanovaTM系列过滤器在高蛋白质浓度下可实现高病毒截留，适用于下一代下游工艺。

研究人员还关注了Viresolve® NFP，以研究ΦX-174噬菌体的LRV在多大程度上取决于溶液pH、电解质浓度和蛋白质类型。结果表明，在低pH值下，当病毒和过滤器表面具有相反电荷时，LRV增加。此外，增加电解质浓度可以增强带相反电荷的表面之间的相互作用，从而提高病毒清除性能。除了溶液pH值和电解质浓度外，不同类型的蛋白质和病毒还可能导致复杂的直接和间接机制，同时影响LRV性能。实验室规模制造的纳米纤维素病毒过滤器在各种进料溶液条件下产生高LRV，可用作下一代病毒过滤器。不同进料溶液成分（包括单个病毒和蛋白质特性、溶液pH值和电解质浓度）获得的结果显示病毒清除性能存在差异，表明溶液化学特性在病毒过滤过程中病毒捕获和蛋白质传输中发挥着重要作用。这表明病毒过滤器的聚合物化学特性对于实现高性能非常重要。此外，生物制药生产过程正在开发为一个连续工艺过程，需要了解溶液化学对病毒过滤性能的影响。

高吞吐量操作

商用病毒过滤器在生物制药的下游工艺中能够提供高效的病毒清除率（超过4-log10），但在高流量条件下，其清除效率可能会降低。Bolton等人的研究表明，在高达60 L/m2的流量下，病毒清除率（LRV）显著下降，蛋白质浓度在LRV的衰减中起着关键作用。高蛋白质浓度可能导致流量严重衰减，LRV的降低可能与流量下降的百分比相关。然而，Khan等人的研究发现，增加蛋白质浓度并不降低LRV，只有流量的减少才与LRV的降低有关。此外，他们的研究还表明，与蛋白质相比，病毒杂质更有可能降低LRV。在高流量条件下，病毒过滤器可能会超过其最大截留能力，导致意外的病毒突破。鉴于下游工艺正朝着连续工艺的方向发展，这可能需要在高浓度进料溶液下进行高流量处理，因此了解在高流量条件下LRV的行为至关重要。

Lute等人报道，在高达500 L/m2的流量下，使用商用过滤器如Viresolve® NFP、PlanovaTM 20 N、Ultipor® DV20和Virosart® CPV进行细小病毒清除时，LRV降低（见图4）。使用Viresolve® NFP过滤器时，LRV显著下降。Ultipor® DV20过滤器也显示出LRV下降，且过滤性能差，导致滤液通量过低而不得不终止工艺。而使用Virosart® CPV和PlanovaTM 20 N过滤器，LRV几乎保持不变，且PlanovaTM 20 N实现了更高的过滤容量，高达500 L/m2。本研究的实验结果进一步通过一个机械模型进行分析，该模型解释了病毒颗粒在过滤器内的沉积以及在过滤器上形成浓差极化层的沉积。

图4. 高吞吐量条件下商用过滤器的对数降低值（LRV）比较。

Jackson等人开发了一个均质膜LRV降低的模型，以检查在高流量条件下的病毒截留行为。他们以Ultipor® DV20作为模式过滤器，该模型方程考虑了过滤层数、筛分系数、未被捕获病毒的浓度分数（游离病毒）和滤液体积。因此，LRV可以用公式3表示：

其中N代表层数，x代表游离病毒的分数，S代表筛分系数，V代表滤液体积，VR代表储存区的体积。该模型成功地将高达100 L/m2的PP7噬菌体的病毒清除与各种初始病毒浓度相关联。此外，研究表明，在高流量条件下，通过保持高达100 L/m2的恒定滤液通量，可以降低LRV。LRV的下降可能与通量的下降无关。

最近的研究集中在商业病毒过滤器在连续生物制药下游工艺中的应用。Lute等人介绍了使用PlanovaTM 20 N和BioEX进行连续病毒清除工艺的可能性，显示了在4天操作期间高病毒清除率的稳健性。Bohonak等人将Viresolve® PRO过滤器与高浓度50 g/L mAb一起使用长达50小时，并获得了对逆转录病毒和细小病毒的高病毒清除性能。他们还建议在预过滤和病毒清除过滤之间采用直接加标方法，用于连续系统。

Shirataki等人使用连续工艺（柱层析，然后病毒清除过滤）研究了病毒清除性能。这证实了将层析与病毒清除过滤步骤相结合有效地提高了蛋白质过滤性，在恒流模式下低通量下具有高病毒清除能力。Tang等人通过使用96孔过滤板开发了一种高通量工艺，用于规模缩小验证商业病毒过滤器，并并行进行了八项实验。开发的工艺预计将用于高通量实验，以减少病毒过滤器和模式产品的使用量。在高通量条件下，不期望的LRV下降取决于溶液条件和/或病毒过滤器的类型。为了防止高通量下病毒的意外突破并利用过滤器的最大载量，有必要在最佳溶液条件下选择合适的过滤器，并进一步考虑连续工艺。

除病毒过滤过程中断

在生物制药的下游处理流程中，病毒清除过滤器面临两个主要挑战：流体流动的异常中断和蛋白质的非期望吸附，这些现象都可能导致产品损失。流体流动的异常中断在过滤过程中表现为不希望的降压事件，通常称为压力下降。另一方面，蛋白质的非期望吸附是指在过滤过程中发生的不希望的蛋白质捕获，这可能导致产品损失和生产中断。有报道指出，这两个问题可能是过滤过程中病毒清除率（LRV）变化的关键驱动因素，但目前对这些现象与LRV变化之间的确切关系尚不完全了解。在本节中，我们将回顾有关蛋白质吸附和压力下降的现有研究，并讨论它们对病毒清除效率潜在影响的争议。

液流中断：压力释放

在生物制药的下游工艺中，病毒清除过滤面临着两个主要的挑战：流体流动的中断和蛋白质污染，这两者都可能导致产品损失。流体流动的中断，在大规模操作中或在缓冲液冲洗步骤后可能会发生，这种在过滤过程中出现的非期望降压现象通常被称为压力释放。这种现象成为问题，因为在压力释放后，观察到病毒突破的现象。为了深入理解和解决这个问题，Zydney的研究团队使用Ultipor® DV20过滤器进行了一系列的实验，观察了压力释放前后病毒突破行为的变化。Woods和Zydney量化了这些变化，并提出了一个假设，即完全的压力释放可能导致“回流”，这似乎是LRV下降的原因。然而，在没有“回流”可能的情况下，当压力没有完全释放时，LRV也经历了类似的下降，这反驳了他们之前的假设。共聚焦显微镜的观察显示，压力释放前后病毒截留行为存在明显的差异。压力释放后，Ultipor® DV20的病毒截留层变得更厚且不那么致密，而压力释放前，病毒截留层则更薄且更致密。这种现象可以用病毒迁移可能降低压力释放后的LRV来解释。这些研究是使用噬菌体作为细小病毒的模型进行的。

在其他研究中，研究者使用两种不同类型的荧光标记噬菌体来确认压力释放导致的病毒迁移。在这项研究中，使用了三种不同的除病毒过滤器（Ultipor® DV20、Viresolve®NFP 和 Viresolve® PRO），目标病毒（ΦX -174）被染成红色（Cy5）和绿色（SYBR Gold）。在压力释放之前和之后分别注射两种染色颗粒，以比较噬菌体截留行为的变化。根据过滤器类型的不同，压力释放前后的病毒截留以及LRV降低也有所不同。Ultipor® DV20 和 Viresolve® NFP 在压力释放后导致LRV显著降低，而 Viresolve® PRO 未检测到显著的LRV降低。在DV20和NFP的情况下，在压力释放之前和之后观察到两个独特的病毒截留层，这表明病毒迁移和截留行为的变化是由减压引起的。然而，Viresolve® PRO 没有观察到病毒截留行为发生变化，并且压力释放时LRV没有显著变化。

图5显示了Ultipor® DV20在压力释放前后病毒截留的差异，清楚地表明减压后病毒截留发生了变化。Fallahianbijan等人使用荧光纳米颗粒作为病毒颗粒，进一步研究了Ultipor® DV20 和 Viresolve® PRO 之间压力释放行为的差异。对于两种过滤器，压力释放之前和之后纳米颗粒的截留行为与荧光标记的噬菌体相似。Nazem-Bokaee等人使用PlanovaTM 20 N和BioEX进行了类似的实验。该研究使用100 nm荧光标记颗粒，并测量了液流中断前后穿过整个过滤器的颗粒强度峰值。对于PlanovaTM 20 N，在液流中断后观察到滤液附近没有强度峰值，表明可能存在颗粒突破。相比之下，BioEX的峰强度没有观察到显著变化。Leisi等人最近使用激光扫描显微镜观察了细小病毒（即MVM）在PlanovaTM 20 N、PegasusTM SV4、Viresolve®Pro 和 Virosart® HC 中的截留情况。结果表明，病毒在活性层的不同深度积累，这与膜结构有关。此外，液流中断通过病毒动员和更深迁移到更致密的膜层来诱导病毒突破。

图 5. 在恒压下过滤荧光标记的 ΦX -174 后（左）和压力释放实验后（右）Ultipor®DV20 的横截面图像。Cy5 标记（红色）噬菌体用于压力释放前的挑战，SYBR 金标记（绿色）噬菌体在压力释放后使用。

一些研究人员专注于确定压力释放期间影响LRV的主要因素。Lacasse等人改变了操作条件，例如施加的压力、减压速度、溶液粘度和液流中断时间。这项研究的重要发现是，较低的施加压力（<供应商推荐的最大压力的70%）、流体流动中断3分钟以及使用典型的低粘度(~ 1 cP)会导致噬菌体PP7和MVM的LRV下降。Kosiol等人通过改变操作参数（例如溶液的pH值、电导率、蛋白质的存在、蛋白质结合能力和过滤器的最大孔径）进行了实验。因此，蛋白质结合能力低、蛋白质浓度低或完全不存在，导致压力释放后LRV急剧衰减。这似乎是过滤器和无囊膜病毒之间的吸附相互作用减少的结果。压力释放的负面影响可以通过改变进料溶液来减轻。Dishari等人报告称，在使用Viresolve® NFP过滤器释放压力后，pH值为4.9且离子浓度较低时，LRV降低几乎可以忽略不计。这一结果可以通过ΦX -174的等电点和膜的zeta电位来解释，其电荷在pH 4.9时相反。因此，病毒和膜之间的相互作用得到加强，并且能够克服压力释放过程中LRV的降低。尽管由于压力释放时病毒截留行为的变化，病毒突破看起来很复杂，但可以修改过滤器的类型和/或进料溶液条件以减轻负面影响。

蛋白质污染

在传统膜工艺中，膜污染一直是影响过滤效率、增加能耗和提高运行成本的关键问题。膜污染的机制通常可以分为四种类型：滤饼的形成、完全堵塞、部分堵塞和标准堵塞。在超滤过程中，滤饼的形成和大分子在膜入口的完全堵塞是常见的问题，而在生物制药的下游工艺中，病毒清除过滤器可能会遇到不希望的蛋白质堵塞、蛋白质聚集或膜孔部分堵塞的问题。在某些操作条件下，如高蛋白质浓度、高操作压力和高通量，蛋白质污染的倾向可能会增加，这可能会影响病毒清除过滤器的性能。过滤器的独特孔隙结构，包括其对称性和孔径梯度，也对蛋白质污染有显著影响。尽管已有研究揭示了一些关键因素，但蛋白质污染对病毒清除性能的影响仍然是一个有争议的问题。

Syedain等人的研究表明，使用Viresolve® 180过滤器时，蛋白质污染可能会对病毒清除率（LRV）产生负面影响。他们使用牛血清白蛋白（BSA）作为模式蛋白，在不同浓度和操作压力下进行了过滤实验。结果显示，BSA污染导致滤液通量随着压力或蛋白质浓度的增加而显著下降，这表明严重的蛋白质污染可能会降低过滤器的整体LRV能力。

Bolton等人的研究表明，使用Viresolve®NFP过滤器时，蛋白质污染对ΦX-174病毒的LRV有负面影响。他们观察到两种不同的污染机制：滤饼的形成和过滤器孔隙的堵塞。尽管滤饼形成（由90 nm的微粒引起），但由于流量几乎100%下降，LRV保持不变。然而，由于21 nm微粒和IgG蛋白单体堵塞孔隙造成的污染导致LRV严重下降，并伴有超过80%的流量下降。

Yokoyama等人的研究也证实了这些发现，他们使用PlanovaTM 35 N过滤器，在5% IgG和白蛋白存在的情况下观察到B19病毒的LRV性能降低。然而，也有研究报告显示，蛋白质污染导致的LRV降低可以忽略不计或没有显著影响。例如，Khan等人在ΦX-174病毒的LRV测试中使用BSA作为模式蛋白，发现不同浓度的BSA不会降低LRV，但ΦX-174形式的杂质会造成严重的过滤器污染，从而降低LRV。

Jackson等人使用干净的Ultipor® DV20过滤器和受BSA污染的Ultipor® DV20过滤器测试了LRV，结果显示，尽管进料通量下降了50%，但两种过滤器之间的LRV没有显著差异。Hongo-Hirasaki等人使用PlanovaTM 20 N过滤器，在1至30 mg/mL的IgG浓度下测量了PPV的LRV。他们发现，尽管较高的IgG浓度最初会降低通量，但无论IgG浓度如何，料液通量在5小时内保持恒定，且PPV的LRV对蛋白质污染没有任何影响。

总的来说，蛋白质污染对病毒清除过滤器性能的影响是一个复杂的问题，可能受到多种因素的影响，包括操作条件、蛋白质类型和浓度、以及过滤器的物理特性。因此，为了优化病毒清除过滤器的性能，需要对这些因素进行仔细的考虑和控制。

图 6. (a) 因蛋白质污染导致通量下降和 (b) 通量恒定时对数降低值 (LRV)。

最近的研究提出了两种污染机制：可逆污染和不可逆污染，这两种机制可以通过蛋白质的特性来区分。Bieberbach等人的研究表明，通过调整进料溶液中蛋白质的特性，可以区分这两种污染机制。具体来说，蛋白质浓度决定了通量是由可逆污染还是不可逆污染控制。在他们的研究中，使用了三种不同类型的抗体，研究了它们的通量下降行为以及缓冲液冲洗和清洁的效果。研究发现，含有高百分比高分子量物质的蛋白质会导致不可逆污染（缓冲液冲洗后没有通量恢复），而其他蛋白质则允许一定程度的通量恢复。不可逆污染不仅会导致病毒清除率（LRV）降低，还可能导致显著的产品损失和操作时间延迟。

图 7. 低浓度和高浓度下蛋白质污染机制的比较。

与传统的除病毒过滤工艺相比，连续生物制药下游工艺所需的过滤时间更长，这加剧了蛋白质污染的问题。在连续系统中，过滤过程可能需要持续几天。此外，连续工艺可能涉及高度浓缩的生物制药产品，这可能导致不需要的中间体和聚集体的形成。尽管已有多项研究证实，商业除病毒过滤器可以在连续系统中使用，但预过滤被证明是有效控制蛋白质污染和提高除病毒过滤能力的方法。

为了进一步研究除病毒过滤过程中的蛋白质污染现象，需要更深入地了解目标蛋白的污染机制。选择适当的除病毒过滤器和进料溶液条件对于最大限度地减少蛋白质污染的不利影响至关重要。

连续工艺开发的局限性

研究人员正在积极探索连续下游工艺，目的是提高生产效率并减少产品损失。一些团队专注于研究低通量条件下的病毒过滤，以及在恒定流量模式下的操作。其他研究小组则在滤液通量较低时检查通量，以研究操作压力如何影响病毒去除性能，并确定在纳滤过滤(NFF)操作中的最佳过滤通量。

Bohonak和Zydney评估了操作压力和过滤器压实对过滤性能的影响，他们发现滤液通量会随着NFF工艺中Viresolve® 180过滤器的变形而变化。Arkhangelsky和Gitis提出，在较高的跨膜压力(TMP)下，由于过滤压实导致孔隙结构变形，LRV可能会降低。PlanovaTM 20 N在低通量操作时，在0.5 bar的压力下LRV降低，这可能会改变在低施加压力下病毒截留的行为。

Fan等人使用四种不同的商业产品进行了恒定通量模式的病毒过滤工艺研究，他们展示了低通量（5 L/m²/h）操作的负面影响。这表明在低通量操作下，扩散力占主导地位时可能会导致病毒突破，而在最佳通量条件下，对流力适当时，病毒过滤器可以展示出较高的病毒去除性能。David等人还证实，使用PegasusTM SV4、Prime、Virosart® CPV和HF过滤器以0.3 L/m²/h的流量和几乎可以忽略不计的操作压力进行72小时的过滤，会导致病毒去除性能降低。

因此，为了克服低通量操作的限制，必须开发出有效的连续病毒过滤工艺。

总结和研究要点

在生物制药的下游工艺中，病毒清除过滤对于减少产品污染的潜在风险至关重要。本综述聚焦于病毒清除过滤技术的最新研究，特别探讨了病毒过滤器的特性和操作条件如何影响病毒去除效率。同时，也强调了当前病毒清除过滤技术在处理工艺中断和连续工艺方面的挑战。研究结果证实，病毒的去除主要依赖于尺寸排阻机制，即病毒颗粒在过滤器孔中的截留，这是由于病毒颗粒和过滤器孔径尺寸相近。

过滤器的各种特性，如其对称性、孔径分布（PSD）和孔的互连性，都会影响整体的病毒清除过滤性能，包括病毒的去除效率和蛋白质的过滤性。其他影响操作条件的因素，如进料溶液的条件、长时间的操作和高通量处理，也会通过改变病毒截留行为和/或过滤器、病毒与蛋白质之间的相互作用，从而影响病毒清除率（LRV）。工艺中断如压力释放和蛋白质污染也会对病毒去除性能产生影响；然而，由于这些影响也依赖于实验条件（例如过滤器类型和进料溶液条件），因此不同研究的报告结果存在差异。

对于商业病毒过滤器在连续生物制药下游工艺中的有效性已经进行了研究，这种过滤器通常需要在恒定通量模式下进行低通量操作。在不引起病毒突破的情况下，实现高蛋白质浓度下的高产品收率和高病毒过滤器处理量是一个挑战。高蛋白质浓度带来的高溶液粘度可能会由于过滤过程中的严重蛋白质污染和浓度极化效应，对病毒去除性能产生显著的负面影响。此外，在长期操作过程中可能会形成不良的中间体或产品聚集。

因此，开发下一代病毒清除过滤工艺需要采取综合方法，特别考虑各种因素，如过滤材料和通过过滤去除病毒的各种机制。

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