支原体全方位检测攻略

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2026-09-09             环球过滤分离技术网              guolvfenlitech6



     在培养细胞的过程中，总会有一些不速来客，比如真菌、霉菌。但最令人头疼的还是支原体，它总是悄悄的来，对细胞造成极大的危害。


支原体是目前为止发现的最小的原核生物，具有以下特点：1.形态结构与细菌相似，但又比细菌小，是介于细菌与病毒之间的微生物；
2.结构简单，只有细胞膜、细胞质、核糖体、DNA、可溶性RNA和一些其它细胞内含物，支原体的细胞器只有核糖体；
3.没有细胞壁，具有多种形态，丝状、球状、扁平状等；
4.体积小，最小的只有0.1μm，部分支原体可通过0.22μm滤器，但过滤器并不能完全去除支原体[1]。

如何危害细胞？

支原体污染一般在显微镜下不可见，很难察觉，但细胞会受到极大的损伤，主要通过以下途径影响细胞生长及功能。

1.污染细胞支原体的种类
污染细胞的种类有在二十种以上，其中95%以上的支原体污染是口腔支原体、精氨酸支原体、发酵支原体、莱氏无胆甾原体和猪鼻支原体五种[2]。2.支原体污染的来源

• 环境污染：如细胞培养房、细胞培养箱、超净工作台内已被支原体污染；
• 实验器材的污染：移液枪、移液管、细胞培养皿、水浴锅等；
• 细胞培养试剂的污染：培养基、胰酶、血清、细胞冻存液等；
• 污染的原代细胞；
• 操作人员操作带来的污染等；
  

       我们可以从以下几个方面预防支原体：1.定期消毒：定期对细胞房、实验服、移液枪、细胞培养箱等进行消毒，及时清除支原体；
2.检查细胞培养试剂：选择来源可靠的试剂及耗材产品，在进行细胞培养操作之前，检查细胞培养基、血清、胰酶等试剂，可选择合适孔径的滤膜进行过滤除菌，使用过程中如发现有污染应及时更换；
3.规范细胞培养操作：建立良好的细胞培养操作SOP，遵循无菌操作原则，规范穿戴实验服、口罩、手套等，并在细胞培养开始时进行消毒；规范处理实验废弃物；
4.在培养基中加入支原体预防试剂：
加入抑制支原体DNA合成的抗生素：例如氟喹诺酮类抗生素；
加入抑制支原体蛋白质合成的抗生素：例如大环内酯类、四环素、双萜烯类等抗生素；

加入非抗生素类支原体清除试剂：如膜活性多肽，通过与支原体膜特异性结合彻底清除支原体。

支原体检测方法

1.分离培养法：

检测方法：将待检样品接种到适合支原体生长的液体培养基或固体培养基中，如有支原体污染，液体培养基颜色会改变，固体培养基将会有菌落疯狂生长[2]。
优点：该方法被称为支原体培养法的金标准，可以检测绝大多数支原体。
缺点：支原体生长到一定数量才能判断是否有污染，检测时间长，无法实现对支原体的快速检测

2.原位染色法：

检测方法：通过染色试剂（如DAPI、Hoechst 等）对待测细胞培养物进行染色，在荧光显微镜下观察待测样品的荧光判断支原体污染。
优点：可清晰直观的看到支原体微粒。
缺点：死亡细胞释放的DNA也会被染色，在支原体轻度污染时，较难判断是否有支原体污染。

3.化学发光法

检测方法：利用支原体特有酶的活性并通过ATP依赖的萤光素酶催化的发光反应进行检测，通过比较检测试剂加入前后ATP量的变化来确定样品是否有支原体污染。
优点：检测快速，仅需15min即可完成检测。
缺点：该方法只能检测活的支原体，如果支原体死亡，将无法通过ATP的变化判断支原体污染。

4.巢式PCR法：

检测方法：通过设计两对引物扩增支原体的DNA，第一对引物用于第一步PCR，用于初步判断是否有支原体污染；用第二对引物进行第二轮PCR，观察DNA条带用于鉴定是否有支原体污染，如图4。
优点: 通过两轮PCR可以大大提高检测的特异性和灵敏度，可根据扩增片段的大小大致预测支原体的种属。
缺点：操作繁琐，需要进行两轮PCR。

5.探针法qPCR：

检测方法：设计特异性引物和荧光探针，通过探针法qPCR高灵敏检测培养的细胞等生物材料中是否有支原体污染。
优点：灵敏度高，检测快速，可一次性检测大量样品，PCR扩增后无需电泳分析即可判断是否具有支原体污染。
缺点：该方法灵敏度很高，因此对实验环境要求较为苛刻，且需要精密的qPCR仪器。

左图是试剂盒中的阳性对照，右图是试剂盒中的Nuclease-free water作为阴性对照，两组对照同时添加了内参对照DNA，FAM为支原体检测信号，VIC为内参对照检测信号。左图的支原体和内对照检测曲线正常，而右图仅内参对照检测曲线正常，支原体为阴性。

6.等温扩增变色法：

检测方法：通过设计4-6对特异性引物，在一定的恒定温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物进行核酸的快速扩增，并且通过颜色变化而无需电泳分析即可确定是否有支原体污染。
优点：不需要反复的升温和降温，不需要精密的仪器，在恒定的温度下即可对核酸进行扩增。反应结束后，无需电泳分析，通过颜色变化即可判断是否具有支原体污染。
缺点：对引物要求较高，需要设计多对引物，且扩增产物不能用于测序。

如果细胞被支原体污染，我们可以及时清除支原体，对细胞进行挽救，减少支原体对细胞的危害。

1.及时更换培养液：可以减缓支原体的污染，但不能完全清除；
2.使用抗生素类去除试剂：抗生素对支原体有较好的抑制作用，可以有效清除支原体，但长时间使用抗生素，会产生耐药性的风险。在使用单一抗生素清除效果不佳时，可以考虑更换抗生素或者采用复合型抗生素试剂；
3.使用非抗生素去除试剂：非抗生素清除试剂不会产生耐药性，对支原体的清除效果可以达到100%，且几乎对细胞没有影响，是去除支原体的首.选试剂。

4.实验室环境清洁
发生支原体污染后，应及时处理已被污染的细胞，并对细胞房进行彻底的清洁和消杀，防止交叉污染。   
实验过程中，避免污染的最好方式还是注意实验规范以及定期清洁，为了不给细菌、真菌、支原体卷土重来的机会，最好同时把实验环境中的污染源也一起消灭,远离污染。

参考文献1.Razin S, Hayflick L. Highlights of mycoplasma research--an historicalper spective.[J]. Biologicals, 2010, 2:183-90.
2.英聪. 应用PCR法检测生物制品中支原体污染[D].华中农业大学,2013.
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