白细胞滤器中白细胞回收及其细胞生物学特点的研究进展

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2023-08-25           环球过滤分离技术网            guolvfenlitech1

        众所周知，临床用血量逐年上升。在血液成分制备过程中，通常会用到白细胞滤器。血液中的白细胞绝大多数被隔离在滤器中而被清除，并被作为生物垃圾处理。事实上，白细胞滤器中的白细胞是可供基础研究和临床应用的细胞资源，并且逐步获得相关研究者的关注。本期推荐一篇发表于《国际输血及血液学杂志》2021年第1期的一篇综述文章，就白细胞滤器中白细胞的回收方法、细胞活性及生物学特点等进行介绍，旨在为促进白细胞滤器中白细胞的再利用，以及白细胞滤器回收所得白细胞的科研和临床应用提供理论基础。

来源：国际输血及血液学杂志, 2021,44(1) : 84-88. DOI: 10.3760/cma.j.cn511693-20200815-00175，作者：张庆利王琳黄凯吴海涛夏长青

目前，成分输血在临床应用上较全血输注更具优势，因其不仅可针对性补充患者所需血细胞成分，而且能大幅降低输血相关不良反应发生风险，如免疫排斥、炎症反应及临床输血感染等[1,2,3]。因此，目前全球范围内多数采供血机构基本向临床机构供应成分血。白细胞滤器是实现成分血采集的重要工具。根据所采集的血细胞成分不同，白细胞滤器主要可分为2种：全血白细胞滤器(leukoreduction filter, LRF)和单采血小板滤器(leukoreduction system chamber, LRSC)。这2种白细胞滤器均在成分血采集过程中，通过孔径的限制使白细胞滞留在滤器中[4,5,6]，从而达到去除成分血中白细胞的目的。通常情况下，这些被使用后的白细胞滤器将作为生物垃圾处理[7]。

近年，虽然相关研究者开始关注对白细胞滤器内白细胞的回收及利用，并且亦有相关研究报道，但是相关领域对其重视仍不足。干细胞和免疫细胞治疗领域中，在干细胞或者免疫细胞供应相对不足的情况下，用于成分血采集的白细胞滤器中的白细胞将是潜在的、巨大的细胞来源。若能合理利用白细胞滤器中的白细胞，其将为基础研究及临床制备干细胞和免疫细胞提供细胞储备。为了促进白细胞滤器中的白细胞被更好利用，笔者将从白细胞滤器中白细胞的回收方法、细胞活性及其相关细胞生物学特点等方面的研究进展进行综述，为白细胞滤器中白细胞资源更好应用于临床及科研提供理论依据。

1　白细胞滤器中白细胞的回收方法及细胞活性


1.1　白细胞滤器中白细胞的回收方法
目前，白细胞滤器中白细胞的回收主要采用平衡盐溶液逆向冲洗滤器的方法，将滤器中的白细胞冲洗至收集容器中。既往研究结果显示，平衡盐溶液冲洗量为40～50 mL，即可达到比较理想的白细胞回收效果[7,8,9]，并且LRSC的白细胞回收量显著高于LRF(P<0.000 1)[10]。最近，Sasani等[11]报道了一种可有效回收白细胞滤器中白细胞的工作系统。该系统利用三通管分别连接一个冲洗液泵和一个吹气装置，以加大冲洗力度，从而达到提高白细胞回收率的目的。该研究亦比较了不同冲洗液对白细胞回收率的影响，结果显示，pH为7.2，含2 mol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)和4%右旋糖苷-40的磷酸缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)是白细胞回收率最高的冲洗液。由于白细胞滤器滤膜可能存在某些对细胞有黏附作用的材料，因此通过调整冲洗液的成分可改变滤膜对细胞的黏附力，从而提高白细胞回收率。

1.2　白细胞滤器回收所得白细胞活性
白细胞滤器回收所得白细胞的良好细胞活性是能够进一步应用这些回收细胞的先决条件。通常情况下，从获得白细胞滤器到成功回收其中的白细胞一般须经数小时，因此需对回收所得的白细胞活性进行进一步检测[12,13]。既往研究结果显示，白细胞滤器回收所得仍然保持很高的活性，单个核细胞的活性95%[12]。有研究显示，白细胞滤器回收所得白细胞中比例较低的中性粒细胞活性较低，这可能与中性粒细胞寿命较短有关。由于中性粒细胞比例较低(约为5%)，而且中性粒细胞在随后的Ficoll密度梯度离心获取单个核细胞的过程中也会被剔除掉，因此其对回收白细胞的数量和质量影响较小。有研究者对白细胞滤器回收所得白细胞进行冷冻，并检测冷冻前、冷冻后白细胞活性发现，冷冻处理对白细胞的活性影响极小，而且冷冻前、复融后白细胞活性均为95%[12]。这一研究发现为大量冻存白细胞滤器回收所得白细胞提供了依据。

2　白细胞滤器回收所得白细胞的细胞生物学特点


2.1　白细胞滤器回收所得白细胞组分及其免疫表型分析
虽然不同研究者对白细胞滤器回收所得白细胞组分的研究结果存在一定差异，但是总体基本一致。研究发现，白细胞滤器回收所得白细胞中，各细胞组分跟外周血白细胞各细胞组分几乎一致[11]。Néron等[12]对LRSC回收所得白细胞进行细胞组分分析的结果显示，采集1、2 U血小板的LRSC中回收所得白细胞总数分别为(0.94±0.49)×109和(1.40±0.56)×109，其中主要为单个核细胞，包括淋巴细胞[(68±8)%]和单核细胞[(25±8)%]，而中性粒细胞比例仅约为5%，还有少量嗜酸、嗜碱性粒细胞。He等[9]研究结果显示，外周血与LRF和LRSC回收所得白细胞中淋巴细胞比例相比，差异无统计学意义(P>0.05)，但是单核细胞和中性粒细胞比例分别相比，差异均有统计学意义(P<0.01、<0.05)。Boudreau等[8]比较LRSC和外周血中白细胞中的T，B，自然杀伤(natural killer，NK)，CD4+和CD8+ T细胞亚群，以及单核细胞比例的研究结果显示，尽管2种来源白细胞中部分细胞组分表型存在一定差异，但是淋巴细胞和单核细胞比例相比，差异均无统计学意义(P>0.05)。上述不同研究结果存在一定差异，这可能与不同研究应用的白细胞滤器，冲洗液的性质及白细胞回收方法不同有关。
近年来，对于白细胞滤器回收所得白细胞的免疫表型分析研究逐步增多。Néron等[12]采用流式细胞术对LRSC回收所得单个核细胞进行了免疫表型分析结果显示，淋巴细胞中CD3+T细胞、CD19+B细胞、CD14-CD16+NK细胞比例分别为(66.7±6.4)%、(13.0±5.8)%及(7.6±2.9)%。同时，该研究对T细胞(CD3+CD45+)及B细胞(CD19+CD45+)进行进一步亚型分析发现，T细胞中存在CD4+、CD8+、CD4+CD27+、CD8+CD27+细胞亚型，而B细胞中存在CD5+、CD27+、IgM+、IgG+、CD27+IgM+、CD27+IgG+、CD27-IgM+、CD27-IgG+细胞亚型[12]。文献报道，除个别细胞组分外，白细胞滤器回收所得白细胞免疫表型跟外周血中白细胞表型基本一致[11]。Dietz等[10]研究发现，LRF与LRSC回收所得白细胞中均包括CD3+、CD4+、CD8+、CD14+、CD19+、CD56+细胞，并且各免疫表型细胞比例相比，差异无统计学意义(P>0.05)[10]。但是，Boudreau等[8]研究发现，CD62L可用于鉴别初始T细胞和记忆T细胞；与外周血白细胞相比，LRSC回收所得白细胞CD62L表达水平显著降低(P<0.05)。这可能与白细胞表面CD62L表达不稳定有关[14,15]。因此，在分析经白细胞滤器回收所得白细胞CD62L表达水平时应注意这一特点。总之，白细胞滤器收回所得白细胞与外周血相近，可为科研及临床提供一个重要且丰富的白细胞来源。

2.2　白细胞滤器中单核细胞及其单核细胞分化的树突状细胞
目前，单核细胞来源的树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前供临床应用和研究的唯一细胞来源。因此，白细胞滤器中的单核细胞的回收将为临床研究和应用提供新的DC来源。DC是调节免疫反应的重要细胞之一。DC通过抗原呈递以刺激抗原特异性T细胞[16]。目前，美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的唯一一种基于DC的免疫疗法已应用于前列腺癌的临床治疗，并且取得积极效果[17,18]。以DC为基础的免疫疗法临床试验较多，用于各种不同临床病症的治疗[17,19]。然而来源于外周血的DC有限的数量和来源是开展相关临床治疗的严重阻碍。He等[9]比较了来自同一批献血者的新鲜外周血中及LRF和LRSC回收所得单核细胞在粒-单细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和白细胞介素(interleukin，IL)-4存在的情况下，培养6 d后的DC形成情况。该研究发现，LRF和LRSC回收所得单核细胞来源DC的形成与来自外周血的单核细胞无明显区别，并且其免疫表型，如人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-DR和CD86的表达比例，也较为相近[9]。Ebner等[20]研究发现，LRF与LRSC回收所得单核细胞分化的DC数量存在差别。Dietz等[10]观察LRF和LRSC回收所得单核细胞分化的DC数量发现，LRSC回收所得CD14+单核细胞中，分化为DC的细胞比例为(29.7±14.6)%，显著高于LRF回收所得CD14+单核细胞的(10.0±9.1)%，并且差异有统计学意义(P＝0.038)。该研究结果证实，与LRF回收所得单核细胞相比，LRSC回收所得单核细胞分化形成的DC数量更多。上述研究结果的差异可能与研究者采用的白细胞滤器、滤器冲洗方法、冲洗液的成分及DC培养方法不同有关。上述研究结果证实，不同来源单核细胞分化的DC数量基本相近。最近，有研究者对LRSC回收所得单核细胞来源的DC进行了免疫表型和功能研究发现，LRSC回收所得单核细胞具备正常分化为DC的能力；采用流式细胞术检测制备所得DC的相关免疫表型的结果显示，其具有典型的DC免疫表型特征，即CD40+ CD80+CD83+CD86+主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ+ MHC-Ⅱ+。并且这些具有免疫功能的DC表面分子在脂多糖刺激下表达水平均显著上调[8]。此外，研究者亦发现，LRSC回收所得单核细胞来源的成熟DC具有非常强的T细胞刺激功能[8]。上述特点为临床应用白细胞滤器回收所得单核细胞分化的DC提供了重要实验依据。单核细胞分化的DC在肿瘤和感染性疾病的免疫治疗，尤其在肿瘤DC疫苗研发中正在发挥重要的作用。鉴于白细胞滤器回收所得白细胞的巨大数量，白细胞滤器回收所得单核细胞分化DC可在以DC为基础的免疫治疗中发挥作用，为DC更好应用于包括前列腺癌[17,18]、肺癌[21]、结直肠癌[22]、肝细胞癌[23]、乳腺癌[24]等肿瘤疾病的治疗提供细胞来源。

2.3　白细胞滤器回收所得T细胞
T细胞是外周血单个核细胞的重要组成部分，白细胞滤器中的T细胞是T细胞基础和临床研究的一个巨大的细胞储备。Pfeiffer等[25]通过磁珠分离的方法从采集1 U血小板的LRSC内可以回收获得(6.3～10.3)×107CD4+ T细胞、(4.2～6.9)×107 CD8+ T细胞。而且细胞活性>91%，纯度>99%。该研究结果表明，白细胞滤器回收所得T细胞数量较高、活性较好，可为探讨T细胞的免疫生物学及临床应用研究提供丰富的细胞来源。该研究亦发现，在DC的刺激下，LRSC回收所得T细胞增殖良好，并可分泌大量的淋巴细胞活化相关细胞因子。这说明，LRSC回收所得T细胞功能没有受到白细胞滤器的影响。研究结果显示，白细胞滤器回收所得的T细胞较全血中T细胞除CD62L表达水平有所下降外，其他免疫表型特征均未受到影响，并且CD62L表达水平的变化很可能是短暂的改变。对二者免疫功能，包括细胞因子分泌水平，免疫功能相关分子(CD107、颗粒酶B)表达水平的进一步比较，均未发现差异存在统计学意义(P>0.05)[8]。上述研究结果证实，白细胞滤器回收所得T细胞的数量与质量均与外周血T细胞相近，是T细胞基础和临床相关研究的可靠来源。

2.4　其他细胞生物学特点
白细胞滤器回收所得白细胞具有其他重要生物学特点。白细胞滤器不会破坏单个核细胞的活性，Nordgren等[26]报道，LRSC回收所得单个核细胞是微生物某些活性分子的反应细胞，因此可作为检测病原微生物的工具细胞。由于LRSC回收所得单个核细胞量大，可以分装冻存，因此可以对病原微生物活性分子采用同一来源的单个核细胞进行检测以保证检测结果的可比性。白细胞滤器回收所得中性粒细胞与外周血中中性粒细胞无显著差异，研究者可采用白细胞滤器中回收所得中性粒细胞提取、纯化具有强力抗细菌作用的蛋白肽(defensins)[27]。体外实验发现，该方法提取所得的蛋白肽具有非常强的抗细菌效应，最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)值为0.12～ 1.00 μg/mL。因此，白细胞滤器回收所得白细胞可做为制备天然分子抗菌药物的原料。

3　总结与展望

目前，绝大多数白细胞滤器中的白细胞都被作为生物垃圾处理。充分利用这一细胞资源将会为基础和临床研究提供巨大的帮助。尤其在免疫细胞治疗中，回收利用白细胞滤器中白细胞能够为如嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell, CAR-T)免疫疗法一类的相关研究提供可供研究的细胞。此外，白细胞滤器中单个核细胞可以冻存后作为献血者的免疫细胞储备。这些细胞可以通过基因工程改造为多种工具细胞用于科学研究。另一热点研究领域，即干细胞研究，也将受益于白细胞滤器中白细胞的回收。CD34+造血干细胞可以通过基因改造或者其他途径使之变为诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)，从而达到根据需求生产大量各类不同组织细胞的目的[28,29]。应用异己细胞于治疗的最大障碍就是MHC在受者体内所引起的免疫排异反应。因此，为了制备通用性的细胞药物，通过基因敲除或者基因修饰的方法使MHC表达水平显著下调或者沉默将是未来研究的方向，而白细胞滤器中回收所得的白细胞能够为这一研究提供细胞来源[30,31,32,33]。此外，为了确保研究和(或)临床应用这些白细胞滤器的安全性，采供血机构应制定严格的白细胞滤器回收操作规程。总之，白细胞滤器中白细胞是一个值得开发的可供基础研究和临床应用的重要细胞资源，并有望在采供血机构与生物技术公司加强合作的前提下，促进白细胞滤器中白细胞的高效回收利用。
利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突


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