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标题: 过滤器如何避免上游支原体污染 [打印本页]

作者: guolvfenlitech6 时间: 昨天 05:40
标题: 过滤器如何避免上游支原体污染

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2026-08-14 环球过滤分离技术网 guolvfenlitech6

近年来，国内生物技术行业发展迅猛，已成为人类健康和制药领域新的风向标，尤其是基于细胞培养和表达的工艺流程，是各种创新治疗产品的关键环节，例如基于CHO细胞体系的抗体或重组蛋白、基于HEK293或昆虫表达体系的病毒载体等。

在细胞培养工艺中，培养基的污染是大家谈论较多的话题。通常情况下，培养基污染可划分为化学污染和生物污染，化学污染包括培养基杂质、内毒素、去垢剂等。生物污染则包含真菌和细菌污染、支原体污染、病毒污染等。

其中，支原体污染是上游科学家最为看重也最为担心的事件。细胞培养过程中支原体的污染可能来源于培养基或添加剂本身、设备和环境、以及操作者等。据文献数据报道，培养基受到单一种群支原体污染的比重约为5-35%，而受到两种或两种以上种群支原体污染的比重则高达7-60%。因此，在细胞培养工艺中，如何有效降低支原体污染的风险，已成为生物工艺中的重要一环。

支原体是一类体积细小（约0.1-0.3μm）、圆形或者丝状的，缺乏肽聚糖类细胞壁的细菌的统称，基于这样的特点，一定数目的支原体可以穿透通常意义上0.2μm的除菌过滤膜，并导致下游料液的污染。因此，在培养基制备的过程中，越来越多的研究员考虑采用0.1μm的过滤膜来降低支原体污染的风险。

与除菌级过滤器类似，部分技术文件提出了过滤器的供应商需对0.1μm除支原体过滤器进行一系列的性能确认（Filter Qualification）的建议，这些确认项目包含但不限于下列内容：

与细菌截留实验相关联的完整性测试数据
支原体去除研究（支原体截留测试）
水流速与压力曲线
灭菌稳定性测试
生物兼容性测试
化学兼容性数据
可提取物测试
USP相关测试

其中，支原体去除研究是评估过滤器降低支原体污染风险的关键性能指标，也是过滤器供应商评估其产品性能的关键要素。完善的支原体截留测试通常包含以下几个重要的考量点：

1）模式支原体选择和培养制备方式

模式支原体：建议采用Acholeplasma laidlawii (ATCC23206)或等效来源菌种，该模式支原体是常见的培养基污染物，能够穿透0.2μm除菌过滤膜，并且在实验室条件下易于高密度培养，是人体非致病性支原体。通常情况下，建议菌种传代次数不超过15次。
培养基：建议采用MTFB (Mycoplasma Task Force Broth)培养基，配制和灭菌方式参见PDA技术报告。
缓冲液：用于菌体稀释和挑战，建议采用磷酸盐缓冲液 (PB), 配制和灭菌方式参见PDA技术报告。
支原体挑战浓度：建议≥107CFU/cm2。

2）挑战用过滤器

0.1μm过滤器，用于支原体截留测试，可以是膜片形式，比如47mm直径膜片，配合夹具构成测试用过滤装置，也可以采用商品化过滤器，比如10英寸过滤器。
0.2μm过滤器，用于阳性对照，过滤器形式和测试过程应尽量与挑战用过滤器相同。

3）测试装置

恒压过滤，可采用压缩空气和压力罐的装置进行测试，应尽量采用较高的测试压力，比如30psi或者更高。
恒流过滤，也可采用恒流泵和压力表的装置进行测试，应尽量采用较高的流速，比如500LMH或者更高。
完整性测试仪，用于检测过滤器的完整性指标。

4）评估标准

0.1μm过滤器的支原体去除性能可以用TR（Titer Reduction）或者LRV（Log Reduction Value）来衡量。
具有优质性能的除支原体过滤器，单位平方厘米（cm2）的有效过滤面积应至少可以截留107CFU模式支原体。
用于阳性对照的0.2μm过滤器，滤过液中应能检测到模式支原体。
测试前后，测试用过滤器和阳性对照过滤器，均通过了完整性测试。

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参考资料

1. L. Nikfarjam et. al., Prevention and Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Culture, 2011

2. Z. Soheily et. al., Detection of Mycoplasma Contamination of Cell Culture by A Loop-Mediated Isothermal Amplification Method, 2018

3.BSR/PDA Standard 05-201x, Consensus Method for Rating 0.1 Mycoplasma Reduction Filters, drafted stage, 2020

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