生物制药中内毒素的下游去除方法汇总 - 环球过滤分离技术网（http://guolvfenlitech.com）是中国过滤.分离.净化.纯化、超洁净技术行业领先的前沿科技、产品和技术信息供求，技术解决方案，技术交流分享以及过滤、分离、纯化、超洁净产品和技术供需服务平台。

通过对比分析各类技术的原理、效率、适用场景与局限性，旨在为不同特性生物制品的内毒素控制提供理论依据与工艺选择参考，并展望下游纯化技术的融合创新方向。

生物制品生产的下游工艺可分为捕获、纯化与精纯三个步骤。其中，内毒素的去除尤为困难。内毒素作为革兰氏阴性菌细胞壁成分，是药品生产过程中难以避免的污染物，其引发的热原反应严重威胁用药安全。在生物制剂的下游纯化中，由于内毒素易与目标产物形成稳定复合物，且其存在形式多样，使其去除极具挑战。

单一的纯化步骤往往难以将内毒素降至法规限值以下，因此，构建一个高效、可靠且经济的内毒素清除策略至关重要。本文将围绕膜分离、色谱分离及其他物理化学方法，梳理并评述其除菌机制与应用进展，以期为工艺开发提供系统性的解决方案。

内毒素在溶液中可呈现为分子量10-30 kDa的单体，也可聚集形成分子量超过1000 kDa、直径达0.1 μm的胶束或囊束结构。基于该特性，超滤技术可依据尺寸排阻效应实现内毒素的分离。具体为内毒素聚集体被截留，而水、盐及小分子目标药物则通过膜进入渗透液。超滤过程中，内毒素的去除效率受其自身聚集状态、目标蛋白浓度及去污剂添加等多种因素影响。研究表明，在过滤污染有内毒素的蛋白溶液时，采用100 kDa截留分子量的超滤膜可使部分内毒素单体进入渗透液，总体去除率在28.9%至99.8%之间波动，且蛋白浓度越低、溶液越稀，去除效果越好，其原因在于稀溶液中内毒素更倾向于以单体形式存在，从而更易穿透滤膜。

此外，添加吐温20等去污剂可进一步促使内毒素聚集体解离为单体，削弱其与蛋白质间的相互作用，使得内毒素更易透过滤膜，而蛋白质则被截留回收。例如，在从小分子药物BMS-753493（分子量1.57 kDa）中去除内毒素的实验中，分别使用3 kDa与10 kDa超滤膜均能将内毒素浓度降至0.03 EU/mL以下，但10 kDa膜可实现约95%的药物回收率，显著高于3 kDa膜约45%的药物损失。然而，超滤技术的适用性仍具局限，尤其适用于从水、盐类及无内毒素结合倾向的小分子药物中分离内毒素聚集体，对于尺寸接近或小于聚集体的分子则去除效率有限。

膜吸附法集成了亲和与离子交换色谱的分离机制，通过固定化配体或功能性介质于膜基质之上，显著提升了传质效率并降低了工艺时间与初始投资。该技术采用纤维素、尼龙、聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）等材料作为载体，具备高流速、低扩散限制等优点，且常一次性使用，避免了洗脱、清洁与再生步骤，从而降低产品污染风险并减少缓冲液用量。然而，膜吸附剂结合容量通常低于传统色谱介质，频繁更换也可能增加长期运行成本。早期研究显示，固定于尼龙膜上的组氨酸标签在内毒素浓度为387 EU/mL时去除率仅为65%，且随内毒素浓度升高效率进一步下降，表明其结合能力存在局限。

近年来，新型膜吸附剂的开发有效提升了去除性能。例如在PVDF基质中引入两亲性碳质颗粒，可实现＞99.8%的内毒素去除率与＞90%的蛋白回收率；而在醋酸纤维素膜中掺入PolyBall纳米颗粒后，其内毒素结合能力达到约2.7×10⁶ EU/mg，优于其在悬浮液中的结合表现（约1.5×10⁶ EU/mg）。因此，膜吸附法在兼顾高产物回收率的同时，正逐步克服其结合容量限制，展现出良好的工业应用潜力[1]。

基于色谱分离的技术，特别是离子交换与亲和色谱，是下游纯化中去除内毒素的核心手段。表1系统梳理了市售填料的配体特性及性能参数，旨在为工艺开发中的介质选择提供直接参考[2]。

阴离子交换色谱通过利用内毒素与目标分子在特定pH条件下的电荷差异实现分离。内毒素的等电点约为2，在常规色谱条件（pH>2）下始终带负电荷，因而可与带正电荷的固定相发生吸附。目标蛋白的带电行为则取决于溶液pH与其等电点的相对关系。当pH高于其等电点时，蛋白质带负电；低于等电点时带正电，等于等电点时为中性。为有效分离带正电蛋白与内毒素，应控制体系pH高于蛋白等电点，使蛋白带强正电荷而被固定相排斥，从而先于内毒素洗脱，而内毒素因与固定相作用被保留。

研究表明，增加填料体积及延长接触时间有助于降低流穿液中内毒素浓度，在适当条件下可实现约400 EU/mL的残留量，且蛋白回收率普遍高于80%。然而，若蛋白与内毒素间存在强静电吸引，或蛋白自身与填料结合过强，均可能导致分离失败或产物损失。例如，在纯化等电点为8.7的Melan-A抗原时，蛋白与内毒素间的强烈相互作用致使内毒素随蛋白一同流穿；通过逐步提高pH至9.2，有效削弱了该相互作用，使流穿液内毒素浓度从1400 EU/mL降至500 EU/mL，且未显著影响蛋白回收率。

总体而言，离子交换色谱能够将高浓度内毒素（>1000 EU/mL）降低多达五个数量级，对较低内毒素水平（<100 EU/mL）亦可实现三至四个数量级的去除。使用后的填料可通过去污剂清洗及再生步骤恢复其吸附性能。该方法的主要局限在于不适用于本身带负电的目标分子，如pDNA及酸性蛋白的内毒素去除[3]。

亲和色谱法利用固定化配体与内毒素间的高特异性相互作用实现分离，具有产物损失低、适用范围广的优点，可用于蛋白质及质粒DNA（Plasmid DNA， pDNA）等目标分子的纯化。配体常靶向内毒素分子中最保守的脂质A区域，通过疏水作用与静电作用与之结合，常用类型包括多粘菌素B（Polymyxin B, PMB）、组氨酸、脱氧胆酸等。其中，PMB能诱导内毒素聚集体解离，并通过其末端的脒基与脂质A的磷酸基团强烈结合，但PMB本身具有一定神经与肾毒性，且其带正电荷的氨基酸可能非特异性吸附带负电的目标分子，导致产品损失。为此，研究者开发了毒性较低的肽类类似物作为替代。此外，含组氨酸的配体或组氨酸标签在纯化中易与内毒素竞争结合位点，造成内毒素残留，且酶切去除标签会增加工艺成本与步骤。

相比之下，脱氧胆酸因电荷密度较低，可减少非特异性吸附，有助于提高产物回收率。除传统配体外，生物相容性材料如纳米颗粒（PolyBall）作为表面吸附型无孔介质，在磷酸盐缓冲液、水及蛋白溶液中均表现出>99%的内毒素去除率及>95%的蛋白回收率，且易于再生和放大，展现出良好的工业应用前景（图2）。

在实际纯化过程中，内毒素的去除效率受溶液pH、离子强度及阳离子种类等因素影响。随着pH升高，尤其在超过填料等电点时，填料表面正电荷减少，对内毒素的吸附能力下降；而离子强度增加，特别是CaCl₂等二价盐的存在，也会显著降低去除效率，但对目标蛋白的回收率影响通常较小。尽管亲和色谱在内毒素去除方面效果显著，部分配体的生物毒性及填充床色谱存在的压降高、传质差等问题仍限制其应用，未来需进一步开发兼具高吸附性能、生物安全性及操作便利性的新型亲和介质[4]。

溶剂萃取技术依据内毒素与目标分子在互不相溶两相中分配行为的差异实现分离。其中，内毒素倾向于进入有机相，而亲水性治疗分子则保留于水相。例如，采用1-辛醇萃取可有效去除多种噬菌体中的内毒素，去除效率介于64%至99.9%之间，但该过程会造成30%-60%的产品损失，且残存于水相的微量1-辛醇可能干扰后续鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate， LAL）检测，需进一步处理。作为改进，非离子表面活性剂Triton X-114构建的温度诱导两相体系被广泛应用于内毒素去除。

该系统在0°C与水混溶，升温至23°C以上发生相分离，使内毒素分配入去污剂相，而目标蛋白留存于水相，内毒素去除率可达45%-99%，且目标产物回收率通常高于80%。若联合十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate， SDS）进行等温提取，该策略对pDNA的内毒素去除亦十分有效，残留量可降至约16 EU/mL，pDNA回收率超过80%。然而SDS会引起蛋白质变性，故该法不适用于蛋白类产品。尽管萃取法具有操作简便、易于放大及在高初始污染下效率突出等优点，其主要局限在于温度循环可能导致产品降解，且经萃取后水相中的内毒素水平常仍高于制剂要求，因此往往还需结合其他纯化步骤方可满足质量规范。

深度过滤与吸附技术通过兼具筛分与吸附的多孔介质，实现了对内毒素的高效去除。该技术不仅依赖孔径排阻截留内毒素聚集体，更关键的是通过在介质基质如纤维素、硅藻土中嵌入季铵盐官能团、聚ε-赖氨酸或PolyBall纳米颗粒等特异性吸附剂，利用静电与疏水作用深度捕获穿透中的内毒素单体与微小囊束。这种“过滤-吸附”协同机制，使其能有效应对不同聚集状态的内毒素，尤其擅长处理高浓度、大体积料液，在初始阶段大幅降低内毒素负载。与后续色谱步骤相比，深层过滤器通常作为一次性使用的前处理单元，无需再生，显著降低了清洗验证风险与工艺时间。研究表明，优化设计的深层滤芯可实现内毒素去除率超过99%，同时保持目标产物高达95%以上的回收率，为下游纯化提供了有力的保障。

下游纯化是保障生物制药最终产品内毒素达标的关键环节。本文所综述的各类技术，从依赖分子尺寸与电荷的传统分离，到基于特异性相互亲和的新型吸附，共同构成了一个多维度、纵深化的内毒素清除体系。未来的发展方向将不仅局限于单一技术的突破，更在于如何根据产物特性，将这些技术进行智能组合与流程优化。同时，开发兼具高载量、高选择性及更低毒性的新型亲和配体与深层过滤介质，推动连续生产工艺的集成，将是提升产品安全性与生产效益的重要路径，其最终目标是构建更为稳健、可控的药品质量保障体系。

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[1] Ribeiro DA, Passos DF, Ferraz HC, et al. Intermediate purification of CHO-derived recombinant human Factor IX using hydrophobic interaction membrane-based chromatography and its comparison to a sulfated resin. Electrophoresis. 2017 Nov;38(22-23):2900-2908.

[3] Chen RH, Huang CJ, Newton BS, , et al. Factors affecting endotoxin removal from recombinant therapeutic proteins by anion exchange chromatography. Protein Expr Purif. 2009 Mar;64(1):76-81.